二、电泳阶段注意事项
电泳操作要点：
1.确保上样一致性：
在进行上样时，必须确保每个加样孔的上样体积保持一致，这样可以避免蛋白条带出现水平不齐的情况。对于空置的加样孔，需要添加与样品等体积的1×loading buffer，以防止相邻通道的蛋白样品发生扩散。同时，上样时应缓慢添加样品，避免快速吹打导致样品溢出，且上样体积应控制在加样孔总容积之内。
2.电泳液的使用：
内槽需要被电泳液填满，而外槽则只需填至1/4处。对于不同厚度的玻璃板，上样量也有所不同。例如，1.0mm厚的玻璃板每孔最多可以上样20μL，而1.5mm厚的玻璃板每孔则可以上样40μL。
3.合理设置电压：
电压的设置需要根据环境温度来调整。在夏季室温较高时，应适当降低电压；而在冬季则可以提高电压。分离胶的固定电压应设为150V。在调节电压时间时，可以参考marker的位置。当marker分开时，表示蛋白已经进入分离胶。此外，在夏季高温时，可以将电泳槽放入冰水中进行降温，以防止凝胶发生变形。
4.常见问题分析：
1.电泳带扭曲或歪斜：
原因分析：这种情况通常是由于电泳液未加足够或发生漏液所导致。
解决方法：在电泳过程中，要及时检查和补充电泳液，以确保电泳槽内的液体保持足够的量，从而逐渐纠正电泳带的走向。
2.电泳带出现拖尾现象：
原因分析：拖尾现象往往是因为样本未能充分溶解。
解决方法：在进行上样前，务必确保样本已经完全溶解，这样可以有效减少拖尾现象的发生。
3.电泳带向两侧过度扩散：
原因分析：扩散过度通常是由于上样量过多所引起。
解决方法：应当适当减少上样量，以控制电泳带的扩散范围，保持电泳带的清晰度。
4.溴酚蓝呈笑脸状：
原因分析：当制胶试剂温度过高或制胶后未能及时保湿时，可能导致胶层不均匀，从而使得溴酚蓝呈现特殊的笑脸形状。
解决方法：在进行电泳时，应降低电压并调节电泳速度，同时确保电泳过程在冰浴条件下进行，以减少胶层不均匀的情况。
5.电泳条带不整齐：
原因分析：条带不整齐可能由于胶凝固不均匀、胶的下边缘存在气泡、上样buffer浓度不准确或在拔梳子时操作不当所导致。
解决方法：应等待胶完全凝固后再进行上样，以确保实验结果的最佳性；电泳前需仔细检查并清除胶底部的气泡；重新配置适宜浓度的上样buffer；在拔梳子时，应水平且缓慢地进行，以确保样品孔的均匀性。
6.电泳条带过粗：
原因分析：条带过粗可能是由于上样量过大、浓缩胶未能有效浓缩、浓缩胶的pH值不准确或电压过高所导致。
解决方法：应适量减少上样量；考虑增加浓缩胶的长度以提高浓缩效果；确保浓缩胶的pH值调整至正确的6.8；同时，适当降低电泳的电压。
通过严格遵守上述电泳阶段的注意事项，并不断优化实验流程，可以有效提升Western Blot实验的成功率，并确保实验数据的准确性和可靠性。
内容来源：Super Lab
责任编辑：展源
审核人：何发